Какво представляват високоспециализираните ДНК изследвания – PCR?

Най-често срещани заболявания предавани по полов път

още

Какво представляват високоспециализираните
ДНК изследвания – PCR?

1

Kласически PCR – Polymerase Chain Reaction – полимеразна верижна реакция: Експериментален метод от молекулярната биология и молекулната диагностика, открита от Кари Мулис . Състои се от няколко стъпки, след които броят на началните ДНК молекули в пробата е увеличен. Това е необходимо, когато няма на разположение достатъчно ДНК за експерименти и анализ.

2

PCR дава възможност на изследователите да произвеждат милиони копия на определена последователност на ДНК за около два часа. Този метод определя самата ДНК или РНК и позволява да се осъществи директно откриване например на инфекциозен агент или на генетична мутация. С негова помощ една молекула ДНК може да се открие в присъствие на милиони други молекули ДНК, Този автоматизиран процес заобикаля необходимостта от използване на бактерии за увеличаване броя на копията на ДНК. Разработена през 1983 г. PCR сега е обща и често незаменими техника, която се използва в медицински и биологични лаборатории за научноизследователска дейност за различни приложения.

3

Приложения на PCR в диагностиката на болестите:

 

  • PCR позволява откриване на наличие или съответно отсъствие на даден патоген – бактериални, вирусни инфекции и паразитози
  • Видова идентификация – един от най-бързите методи за целта
  • Генотипизиране – типизиране на щамовете
  • Ранна диагностика на злокачествени заболявания –
    левкемии, лимфоми и др.
  • Диагностика на наследствени заболявания
  • Генотипиране на известни мутации
  • Идентифициране на генетични отпечатъци – използва се
    в криминалистиката и тестовете за бащинство

Намножаване на ДНК/РНК за последващи процедури –
блот, секвениране и т.н.

4

ДНК  (Дезоксирибонуклеинова киселина) –  нуклеинова киселина, която носи генетичните инструкции за биологическото развитие на всички клетъчни форми на живот и много от вирусите. Нуклеиновите киселини са изградена от захари, пуринови, пиримидинови бази и остатък от фосфорна киселина. Основната функция на молекулата на ДНК е дълготрайното съхранение на информация  –> носител на генетичната информация.  Представенa е от двойноверижна спирала изградена от нуклеотиди.

ДНК-биологична функция – репликация на
генетичната информация.

РНК-биологична функция – транскрипция и транслация на генетичната информация.

5

Вид на пробата:

 

  • кръв, серум, плазма, урина
  • тъкани и клетки – бактериална култура, клетъчни култури, бели кръвни клетки, епителни клетки
  • слюнка, фецес, сперма, кости, зъби, косми и т.н.
  • перикардиална, плеврална, асцитна течност, спинална, синовиална, амниотична течност и т.н.

6

Общи изисквания към пробата:

 

  • не се препоръчва замразяване на кръв, серум, плазма и урина
  • ДНК/РНК трябва да се изолират в рамките на 48 ч. от вземане на биологичния материал, който се съхранява на 4 градуса /изключения – тъкан, клетъчна култура и клетъчна фракция/
  • ДНК е стабилна молекула, може да се работи на стайна температура и може да се съхранява продължително време на – 20 градуса, но трябва да се избягва често размразяване и замразяване.
  • РНК е нестабилна молекула (разграждане от ензими РНази), съхранява се на – 80 градуса, като се избягва честото размразяване и замразяване. С проба може да се работи до 1-2 ч.
  • Препоръчва се РНК да бъде превърната в копие ДНК, което може да се съхранява на -20 градуса, или да се анализира в същия ден.
  • в зависимост от диагностичната цел може да бъде необходима предварителна обработка на материала – набогатяване, изолиране на клетъчни фракции, предварителна амплификация и т.н.

7

Вземане на пробата:

  • Кръв за анализ може да се вземе кръв от вена, артерия, капиляри, като се предпочита венозната кръв – венепункция и капилярна кръв – кожна пункция чрез ланцети при малки деца
  • Урина рядко се използва в молекулярната диагностика за геномно тестване, но в някои лаборатории я използват за скрининг на ракът на пикочния мехур и мониторинг на неговата терапия. Често се използва при молекулярно тестване за някои инфекциозни агенти, като Chlamydia и обичайните полово преносими организми. Взема се първа сутрешна урина, след тоалет, в стерилен контейнер. За бактериално изследване при детекция на уретрити са подходящи първите 20 мл., докато средните порции са най-подходчщи за откриване на нарушения в мехура, включително на геномни аномалии в клетките на мехура, свързани с неоплазмата. Може да се вземат и катетърни проби, както и супрапубична пункция.
  • За диагностика на полово предаваните заболявания /Chamydia trachomatis, Mycoplasma, Ureaplasma и др./ като правило се прави цитонамазка от епителни клетки от цервикален канал или уретра, може да се използва също слюнка и урина.

Най-често срещани заболявания предавани по полов път

1

Бактериалната вагиноза е най-честата причина за наличие на флуор при жени в репродуктивна възраст. Характеризира се с патологично разрастване на нормална вагинална флора, съпроводено от изчерпване на водороден прекис-продуциращите лактобацили и свръхразмножаване на анаеробни Бактерии асоциирани с BV:

  • Gardnerella vaginalis – 95%
  • Prevotella spp. – 76%
  • Peptostreptococcus spp. – 36%
  • Mobiluncus spp. – 24%
  • Mycoplasma hominis – 48-63%
  • Aнаеробни микроорганизми – живеещи при отсъствие на кислород, използвайки други окислители за катаболитните си процеси

Сексуално предавана ли е бактериалната вагиноза?

Полово-предаваният път не е задължителен, но по-висок % на заболеваемост се наблюдава при полово активни жени. Партньорите на пациентки с BV може да имат уретрит асоцииран с G. Vaginalis. Лечението на сексуалния партньор не предпазва от рецидиви (повторна поява на инфекцията) при жената. Сексуално не-активни жени също могат да имат BV.

Симптоми: лоша миризма и сиво-бял флуор.

Клинично протичане: Бактериалната вагиноза може да протече с изявени симптоми или безсимптомно при 1/2 от пациентките. Инфекцията протича, както остро, така и епизодично. Рецидиви се наблюдава при 30% от пациентките до три месеца след лечение, а също и периодични появи на инфекцията Макар и рядко са описани случаи на спонтанно обратно развитие (изчезване на инфекцията).

Диагноза: Изследва се вагиналното съдържимо, като се измерва се рН. При стойност на рН > 4,5 и отделена остра миризма на риба при накапване с калиева основа, така наречения “whiff test”, може да бъде поставена диагноза. На микроскопски препарат от вагинален секрет се наблюдават т.нар. ”clue cells” – това са разрушени епителни клеки с полепнали по тях G. vaginalis.

2

Трихомоназата е вагинална инфекция, която се причинява от паразита Trichomonas vaginalis (протозои с централно ядро и 4 камшичета). У жената причинява инфекциозен вагинит, а при мъжа-баланит, баланопостит и слабо проявен уретрит. Мъжете могат да служат като асимптомен резервоар и вектор на трансмисия.

Сексуално предавана ли е трихомоназата?

Да. Инфекцята се предава почти изключително по полов път. Има описана и не- сексуална трансмисия – изолиране на T. vaginalis от тоалетни чинии, бани, както и при не достатъчно хлориране на водни басейни.

Симптоми: У жени симптомите са обилно зеленикаво-жълто пенесто вагинално течение с тежка сладникава миризма. В 10-15% от жените и в 50% от мъжете може да има безсимптомно носителство.

Диагноза: При гинекологичен преглед се установява зачервяване на шийката на матката, т. нар. „ягодов цервикс“. Диагнозата се поставя след изготвяне и наблюдаване на нативен препарат, изолиране на причинителя на специална среда и търсене на антиген и ДНК.

3

Кандидозата е вид инфекция причинена от дрождeподобни гъбички от от род Candida, най-честата от които е Candida albicans. Гъбичките от род Candida са широко разпространени в околната среда и са нормални обитатели по кожата и лигавицата на човека. При продължително лечение с антибиотични средства например се стига до силно потискане на нормалната за човека флора и възниква състояние наречено дисбактериоза. Тогава се създават благоприятни условия за размножаване на гъбите, намиращи се в човешкият организъм и е възможно развитието на кандидоза. Същото се получва и при понижаване на имунната защита на макроогранизма, при болести на обмяната на веществата, при увреждане на кожата и др.

75% от жените имат поне един епизод от този тип инфекции, като от инфектираните 40-50% развиват рецидиви.

Сексуално предавана ли е кандидозата?

Не. Тази инфекция не е полова предавана. Тези дрождеподобни гъбички са нормални обитатели на вагината и гастро-интестиналния тракт, но при някои условия (прием на антибиотици, кортикостероиди, бременност, орални контрацептиви, диабет, генетична предразположеност и др…) броят им се увеличава и се развива възпаление.

Симптоми: При жени – наблюдава се сърбеж, парене при уриниране и бяло или жълто гъсто, подобно но кисело мляко вагинално течение. При мъже – 10 % от партньорите развиват кандидозен баланит.

Диагноза: Поставя се с микробиологично изследване на вагиналното съдържимо чрез специални хранителни среди и микроскопски препарати.

4

Хламидиазата  е инфекция причинена от вътреклетъчния микроорганизам  Chlamidia trachomatis, възлов проблем, засягащ репродуктивното здраве. Тя е най-значимата сексуално предавана инфекция в икономически аспект след ХИВ инфекцията – над 700 милиона регистрирани случаи в света. Действителното разпространение и честота са много по-големи, поради хроничните и асимптоматични случаи. Често гениталната хламидийна инфекция персистира месеци и години със сериозни усложнения, особено при жени.

Сексуално предавана ли е гениталната хламидийна инфекция?

Да. Предава се по полов път.

Клинично протичане: И при мъже и при жени по-често протича без клинични признаци.

Симптоми: При мъже – развива се уретрит, епидидимит или простатит. Инфекцията протича със почти прозрачен секрет от уретрата със или без възпаление, болка, парене, дразнене и често уриниране. Хламидийната инфекция може да бъде причина за стерилитет и при мъжете. При жени – в 70% от случаите протича като асимптомна самоограничаваща се инфекция. Може да причини цервицит, характеризиращ се с воднист или мукопурулентен секрет, кървене при допир и ранимост на лигавицата. Може да е и тежко заболяване със сериозни усложнения на репродуктивния тракт на жената.